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技术论文

来源:瑞和祥药业
2014-11-24
抗菌肽的研究进展
李波 (北京中农颖泰生物技术有限公司,国家饲料工程技术研究中心,北京,100193)
 

  本文主要从分子结构及功能角度阐述了抗菌肽的分类,以及抗菌肽在不同领域的应用情况,最后对抗菌肽的作用机制和生物学活性作了简述。

  1、抗菌肽概述
  抗菌肽是一类不易导致微生物耐药性的新型抗感染多肽。世界上发现的第一种抗菌肽是天蚕素,1980年由瑞典科学家Boman等用阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹产生出有抗菌活性的多肽物质,定名为天蚕素(cecropins)。随后又在其他生物体内陆续发现了多种抗菌肽,如蛙皮素(magainins)、蜂毒素(melittins)、防御素(defensins)等。目前世界上已知的抗菌肽共有1200多种。由于最初人们发现这类活性多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性,因而命名为抗菌肽。随着研究工作的深入开展,发现某些抗菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有很强的杀伤作用。抗菌肽的结构与功能密切相关,来自不同物种的抗菌肽分子结构有一定的差别,按分子结构及功能将抗菌肽分为5类:
  1.1 具有螺旋结构的线性多肽
  天蚕素是第一个被发现的动物抗菌肽,此后,人们相继从家蚕、柞蚕、果蝇、麻蝇中分离到天蚕素类抗菌肽,它们对革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌具有很强的杀伤力,且对真核细胞没有毒性。天蚕素抗菌肽一般含有37~39个氨基酸残基,具有以下结构特征:①不含半胱氨酸,不形成分子内二硫键;②N末端区域富含亲水碱性氨基酸残基,如赖氨酸和精氨酸,这将有利于天蚕素吸附到带负电的细菌细胞膜上;③C末端含较多的疏水性氨基酸残基,疏水性的尾部有利于抗菌肽插入细菌膜的双层脂质膜中;④分子的两端各形成一个两亲性α螺旋,这种α螺旋是破坏、裂解细菌的主要结构。蛙皮素也是较早发现的一类具有双亲螺旋结构的抗菌肽。最初是从蟾蜍的皮肤中分离得到的,后来在哺乳动物的神经组织和肠组织中发现了其类似物。蛙皮素对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、原生动物都有杀伤作用,但是对革兰氏阴性菌的活性比天蚕素要低10倍左右。 
  1.2 富含某种氨基酸的线性多肽
  Apidaecins是从蜜蜂中分离得到的富含脯氨酸的抗菌肽,一般含有16~18个氨基酸残基。Apidaecins对某些革兰氏阴性菌具有很强的活性,而对革兰氏阳性菌不起作用。Apidaecins对某些革兰氏阴性菌和肠杆菌科的致病菌具有很高的杀伤力,使其在植物抗细菌病和食品工业中有着很好的应用前景。Drosocin是来源于果蝇的一种富含脯氨酸的抗菌肽,在结构上与Apidaecins具有一定的相似性,但是在其11位的苏氨酸羟基上连接着一个O-二糖链。Coleoptericin和Hemiptericin分别来源于鞘翅目和半翅目昆虫,一级结构中富含甘氨酸,分子量一般较大。 
  1.3 含有一个二硫键的多肽
  这是一类数量很少的抗菌肽,第一个被发现的这类多肽是Bacterianecin,来源于牛中性粒细胞。其12个氨基酸中含有4个精氨酸,第2位和第11位氨基酸残基间有二硫键。Bacterianecin对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抗菌活性。
  1.4 含有两个或两个以上二硫键的多肽
  这类多肽的典型代表是防御素,最初发现的α-防御素来源于哺乳动物的组织中,一般含有29~34个氨基酸残基,其中6个保守的半胱氨酸形成3个分子内二硫键。防御素对革兰氏阳性菌的活性比革兰氏阴性菌强,但其活性比天蚕素弱,并且通常在低离子强度下起作用。昆虫防御素在C末端与α-防御素相似,但是只有两个β片层结构,中间有一段α螺旋起稳定作用,主要对革兰氏阳性菌起作用,而对真菌没有作用。植物防御素一般有45~54个氨基酸残基,可形成4个二硫键,3个β片层结构和一个α螺旋结构,一般只对真菌起作用。 
  1.5 羊毛硫抗菌肽
  羊毛硫抗菌肽(Lantibiotics)是指一些由细菌产生的含有一些特殊有机基团的多肽。其中研究最广泛的是乳链菌肽(Nisin)。它是来源于乳酸菌的一种抗菌肽,成熟多肽由34个氨基酸组成,含有羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸等特殊基因。主要对革兰氏阳性菌起作用,已被广泛应用作食品保鲜剂。乳链菌肽及其类似物在医药上的应用研究也正在进行。 
  2、抗菌肽的应用
  从目前对抗菌肽的生物学特点和作用机制的研究看,抗菌肽有很广的应用范围:
  2.1 医药领域
  目前的研究结果预示,抗菌肽在临床上的使用将带来生物医药领域的“绿色革命”。无论是来源于人类还是来源于细菌、病毒、植物、脊椎动物及非脊椎动物的抗菌肽都似乎有一个共同的结构特征。人们可以根据这一结构特征来设计合成新的多肽作为治疗性药物。广泛的动物模型研究和临床实验已经证明,自然存在的肽类(包括防御素)和外源基因合成的肽类均能防止细菌和真菌引起的局部或系统感染。所以,抗菌肽可用于临床预防和治疗某些病原微生物的感染。目前,已进入临床实验阶段的抗菌肽有细菌素、源于蛙马盖宁的 MSI-78 及源于猪 Protegrin的 IB-367。目前,发展抗菌肽作为治疗性药物有以下几个策略:①作为单一抗感染药物;②与传统抗生素联合应用发挥协同效应;③作为免疫刺激物增强机体的先天性免疫能力;④作为内毒素中和物质减轻细菌毒素引起的败血症性休克。 
  2.2 食品领域
  有研究表明,抗菌肽有可能替代传统化学性防腐剂,它不仅可以保持肉类食品的风味,更重要的是它不会给人体带来任何毒副作用,人畜食用后易被体内蛋白酶水解消化。现已在巴氏消毒奶、高温灭菌奶、蘑菇罐头、鲜春笋罐头、蔬菜罐头、瓶装酱菜、豆奶、内脂豆腐、西式火腿、酱牛肉、鲜牛肉、澳式烤肉、即食腊肉制品进行了成功的实验,对产品的营养价值及口味都有所改善,防御素已在食品加工中得到应用。在香肠中可以部分替代亚硝酸钠,可以全部或部分替代山梨酸钾。抗菌肽在酸性条件下活性很强,而且能耐很宽的 pH 值范围,所以对于酸性食品,尤其对饮料来说,由于抗菌肽有良好的溶解性,是非常好的防腐剂。目前乳链菌肽己经在 50多个国家注册为食品保藏剂。 
  2.3 农业领域
  抗菌肽在农业上的应用主要有两个方面,一是取代或部分取代目前喂养动物所用的抗生素,减少养殖动物对抗生素的依赖,减少抗生素通过食物链的传播,减少对人类的威胁;二是通过转基因技术将广谱抗菌肽基因导入动植物体内,增加动植物对各种病原菌的抵抗能力。大量的研究表明,天蚕素抗菌肽能抑制多种畜禽病原菌,如猪水肿病菌、猪肠炎沙门菌、鸡大肠杆菌(具毒素株)、鸭大肠杆菌和流产杆菌等。用抗菌肽作为饲料添加剂,能很好地解决了饲用抗生素的问题,这也是抗菌肽在畜牧业上最直接的应用。抗菌肽又是鱼、虾、贝等水生动物抗病毒防御系统的主要成分之一。姜兰等(2002)将基因重组抗菌肽的发酵产物浓缩干燥,添加到饲料中,对中华鳖红脖子病、赤斑病、穿孔病等一些常见病具有一定的防治效果。陈晓生等(2005)研究表明,用抗菌肽作肉鸭饲料的新型环保添加剂,能有效提高肉鸭生产性能,同时对免疫器官没有不利影响。 
  2.4 动植物育种
  植物病害多达数百种,几乎所有作物在生长期内都会遭到不同程度的危害,培育抗病新品种是防治植物病害的根本途径。抗菌肽具有广谱杀菌效果及不易引起病原微生物产生耐药性等优点,因而,将抗菌肽基因转入动植物,是培育抗病新品种的有效策略。 
  3、抗菌肽的抗菌机制及生物学活性
  3.1 抗菌肽的抗菌机制
  抗生素抗菌机制是抗生素与病原体特定部位的受体结合从而使病原体的正常结构遭到破坏或使某些生物合成受阻,以达到抑菌或杀菌的作用。当其作用的靶位点发生改变时,抗生素就会失去其抗菌作用,这是微生物易于对抗生素产生耐药性的根本。目前认为天蚕素抗菌肽的抗菌机制为:抗菌肽以物理的方式作用于细菌的细胞膜,使细胞膜穿孔、细胞质外溢而将细菌杀死。由于天蚕素类抗菌肽均具有疏水和亲水的两亲性特征,带正电荷的分子与细胞膜磷脂分子上的负电荷形成静电吸附而结合在细胞的磷脂膜上,随后天蚕素抗菌肽分子的疏水端插入细菌细胞膜的脂质膜中,进而牵引整个分子进入质膜,扰乱质膜上蛋白质和脂质原有的排列秩序,再通过天蚕素抗菌肽分子间的相互位移而聚合形成跨膜离子通道,细胞质外流,细胞内离子大量丢失,细菌不能维持正常生命活动所需的胞内渗透压而死亡。 
  抗菌肽只对原核生物细胞产生特异性的溶菌活性,对最低等的真核生物如真菌及某些植物的原生质体、某些肿瘤细胞等也有一定的杀伤力,而对人体正常的细胞则无损伤作用。这种特性的原因在于原核细胞和真核细胞结构尤其是膜结构的不同,真核细胞质膜含有丰富的膜蛋白和胆固醇,特别是后者的存在,使细胞膜趋于稳定,而且哺乳动物细胞中还存在高度发达的细胞骨架系统,其中的微丝、微管与质膜内层有着许多结合位点,这种结构是细胞维持特殊形态和渗透压的首要因素,它的存在抵抗了天蚕素抗菌肽的溶菌作用。用细胞松弛素将哺乳动物细胞中的骨架结构去除后,此细胞对抗菌肽的溶菌作用很敏感。此现象的意义在于,许多癌细胞的细胞骨架系统与正常细胞相比是不发达的,体外实验表明,对正常细胞无毒性浓度的抗菌肽可以杀死许多癌细胞株。
  3.2 抗菌肽的生物学作用
  3.2.1广谱抗菌作用 
  抗菌肽的抗菌谱较传统抗生素宽,传统抗生素通常只对细菌有效,而对真菌、病毒等病原体无效。抗菌肽既有抗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的作用,又有抗真菌、抗病毒作用。抗菌肽不仅自身具有良好的抗菌活性,不同天蚕素抗菌肽与传统抗生素联用,还可提高各自的药物疗效,甚至拓宽传统抗生素的抗菌谱,这也是近年来对天蚕素抗菌肽研究中的一个新发现。实验结果表明,抗菌肽synerporin S-10和 synerporin LSB-1 与替卡西林联用能明显提高替卡西林的抗菌活性。synerporin C2 与抗真菌药物联用,可明显降低两性霉素B 和制霉菌素的用药量,既达到了治疗目的,又减少了用药量,降低了抗真菌药物的毒性副反应,这是很有实用价值的新发现。 
  3.2.2 抗病毒作用 
  研究发现烟芽夜蛾幼虫的血淋巴对多种DNA、RNA病毒有明显的抑制作用,使病毒的感染力降低。人中性粒细胞防御素 HNP-1对疱疹病毒有抑制作用。 
  3.2.3 抗肿瘤作用 
  在真核细胞的质膜中含有丰富的膜蛋白和胆固醇,细胞中发达的微丝、微管与质膜结合,使得细胞膜比较稳定。正是这些发达的细胞骨架使真核细胞具有较强的抵抗天蚕素抗菌肽对细胞的溶解能力。但是某些肿瘤细胞的细胞骨架系统不发达,细胞质膜易被天蚕素抗菌肽插入而形成离子通道,最终将肿瘤细胞破坏而达到治疗肿瘤的目的。实验研究表明 1μg/ml 的天蚕素抗菌肽与肿瘤细胞作用 14h 就有明显的杀瘤作用。天蚕素、爪蛙素、鼠天蚕素抗菌肽 NP-1 和 NP-2 及天蚕素抗菌肽HNP-1 均表现出对肿瘤细胞如纤维瘤细胞、宫径癌细胞、肺癌细胞等的杀伤作用。 
  3.2.4 促进伤口愈合 
  抗菌肽能刺激纤维母细胞、淋巴细胞和血管内皮细胞的增殖,促进创面肉芽组织的增生,加快创面愈合。分别用抗菌肽和磺胺嘧啶银制成的软膏治疗小鼠烧伤,天蚕素抗菌肽组愈合快,疤痕小,磺胺嘧啶银组虽然创面感染得到控制,但烧伤创面愈合较天蚕素抗菌肽组慢,疤痕也较天蚕素抗菌肽组大。 
  4 问题与展望
  目前看来,生产抗菌肽的技术有3种:①从动物和植物中提取;②化学合成;③用蛋白质重组技术表达抗菌肽,并用发酵技术生产。从动物和植物中提取的优点是,抗菌肽的活性高、稳定,专一性强,技术难度相对较小,但由于动植物组织中抗菌肽含量有限,成本过高。化学合成抗菌肽成本太高,对环境污染也比较大。因此由于成本的原因,用提取和化学合成技术生产抗菌肽很难在实际生产,尤其是在畜牧养殖业上应用。 
  蛋白质重组技术和发酵工程技术的发展,使科学家能够利用这些技术提高抗菌肽的产量,克服提取和化学合成技术在抗菌肽领域遇到的难题。因此蛋白质重组技术和发酵工程技术是抗菌肽生产技术的发展趋势。(文章来源:阿里巴巴以商会友.商友圈)
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